تولید پلی هیدروکسی بوتیرات باکتر یایی و بررسی سمیت و ساختار میکرو یا نانوی آن

پلی استرهای باکتریایی، پلیمر های زیست تجزیه پذیر و زیست سازگاری هستند که توسط طیف وسیعی از میکروارگانیسم ها سنتز می شوند. هدف این تحقیق جداسازی سویه های تولید کننده پلی هیدروکسی بوتیرات، تولید و کاربرد آن در ارسال دارو می باشد. بیش از 120 سویه باکتری از جنس های متفاوت توسط روش رنگ آمیزی زنده کلنی ها، جداسازی و غربالگری شدند. دو سویه رالستونیا و سینوریزوبیوم با بازده و قابلیت تولید بالای پلیمر از طریق تست های مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و تعیین توالی ژن 16srrna شناسایی شدند. شدت فلورسانس نسبی سلول ها در محیط مایع تولید پلیمر در زمان های متفاوت از رشد، توسط رنگ آمیزی نایل رد و از طریق فلوسایتومتری سنجش و سینتتیک تولید پلی هیدروکسی بوتیرات تعیین شد. بهینه سازی مرحله به مرحله فاز رشدی و فاز تولید پلی هیدروکسی بوتیرات در کشت بسته خوراک دهی شده و دو مرحله ای رالستونیا و سینوریزوبیوم توسط روش تاگوچی انجام شد. طراحی محیط کشت رشد سلول ها در تراکم بالا، تعیین زمان خوراک دهی و استراتژی خوراک دهی بر اساس زمان اتمام یون آمونیوم و در بیشترین حالت از تولید بیوماس سلولی انجام گرفت. با توجه به منحنی رشد و تولید محصول در دو باکتری فوق، تولید پلی هیدروکسی بوتیرات تا حدودی وابسته به رشد می باشد. تاثیر دما بر رشد و افزایش بیوماس سلولی و همچنین تغییر در محتویات پلی هیدروکسی بوتیرات سلولی مورد بررسی قرار گرفت. افزایش دما در فاز رشدی، سبب توقف رشد سلول ها شد اما تولید پلی هیدروکسی بوتیرات را بطور قابل توجهی افزایش داد. مطالعه و بررسی رفتار های تک سلولی در زیر جمعیت های یک جنس باکتری در طول مراحل رشدی و فاز تولید پلی هیدروکسی بوتیرات توسط فلوسایتومتری انجام گرفت. کل جمعیت باکتری ها از سه جنس متفاوت رالستونیا، سینوریزوبیوم و ازتوباکتر مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج نشان دادند که به محض ورود سلول ها به فاز لگاریتمی، چهار زیرجمعیت مشاهده می شوند که دارای خصوصیات متفاوتی ازنقطه نظر تولید گرانول های پلی هیدروکسی بوتیرات (پارامتر fl2) و تقسیم سلولی (پارامتر ssc) می باشند. زیرجمعیت های qa1 و qa3 سنتز گرانول های پلی هیدروکسی بوتیرات را آغاز نکرده اند، ولی دو زیر جمعیت دیگر (qa2, qa4)، در حال سنتز پلی هیدروکسی بوتیرات می باشند. پروفایل ایجاد زیر جمعیت ها در جنس ازتوباکتر به طور کامل از دو باکتری قبلی متفاوت بود. در این باکتری، در ابتدا دو زیر جمعیت در ساعت 12 و سپس چهار زیر جمعیت در ساعت 24 مشاهده شدند. سپس پلی هیدروکسی بوتیرات از بیوماس سلولی استخراج و خالص سازی شد و برای آنالیز فیزیکو- شیمیایی مورد استفاده قرار گرفت. در قسمت بعدی از این تحقیق، پلیمر خالص برای تولید نانوپارتیکل ها از دو روش دیالیز و نانوپرسیپیتاسیون مورد استفاده قرار گرفت. سپس کارآیی کپسوله کردن و رهاسازی دو نوع داروی هیدروفوب (رتینوئیک اسید) و هیدروفیل (آلبومین سرم انسانی) بررسی شد. از پلیمر plga و نانوپارتیکل های تولید شده از آن برای مقایسه استفاده شد. در این تحقیق سعی شد تا با استفاده از روش های دیالیز و نانوپرسیپیتاسیون، نانوپارتیکل هایی با اندازه و خصوصیات فیزیکوشیمیایی مناسب تولید شوند که دارای توانایی کپسوله کردن دو داروی فوق را داشته باشند. پلورونیک f-127 به عنوان سورفاکتانت به فرمولاسیون اضافه گردید تا یک سوسپانسیون پایدار از نانوپارتیکل ها با سایز یکنواخت تولید شود. . اندازه نانوپارتیکل های بدست آمده از روش دیالیز 55±140 نانومتر می باشد. نانوپارتیکل های لود شده با رتینوئیک اسید، یکنواخت و با اندازه مناسب 37±132 نانومتر مشاهده شدند. این نتایج نشان می دهد که روش دیالیز برای تولید نانوپارتیکل های پلی هیدروکسی بوتیرات با اندازه بسیار کوچک، یک روش مناسب می باشد. کارآیی کپسوله کردن دارو در این روش 4 درصد می باشد. همچنین نانوپارتیکل های یکنواخت با اندازه 25±124 نانومتر از روش نانوپرسیپیتاسیون تولید شدند. کارآیی کپسوله کردن رتینوئیک اسید در نانوپارتیکل های پلی هیدروکسی بوتیرات از این روش، 32 درصد می باشد. پروفایل رهاسازی رتینوئیک اسید از نانوپارتیکل ها در محیط in-vitro مورد بررسی قرار گرفت. برای سنجش سمیت نانوپارتیکل ها، از لاین سلولی فیبروبلاست 3t3/balb و بر طبق پروتوکل iso 10993 استفاده شد. ic50 برای نانوپارتیکل های پلی هیدروکسی بوتیرات تقریبا برابر با 12 میلی گرم در میلی لیتر می باشد. بالا بودن ic50 بیانگر این موضوع می باشد که نانوپارتیکل های تولید شده، زیست سازگاری بالایی دارند و می توانند برای کاربردهای پزشکی مورد استفاده قرار بگیرند. برای بدام انداختن fitc-hsa توسط نانوپارتیکل ها، از روش نانوپرسیپیتاسیون استفاده شد. میانگین اندازه نانوپارتیکل های تولید شده بین 50±85 نانومتر می باشد که یک نتیجه بدست آمده و بسیار عالی می باشد. کارآیی کپسوله کردن پروتئین 5±24% می باشد. میانگین اندازه نانوپارتیکل های plga-plu تشکیل شده به عنوان کنترل، 31±127 نانومتر بود. کارآیی کپسوله کردن آن ها 92 درصد اما رها سازی اولیه دارو بالا می باشد. سپس فرمولاسیون های متفاوتی تهیه و فاکتورهای فوق در آن ها سنجش شد. کارآیی کپسوله کردن پروتئین ها با افزودن پلی وینیل پیرولیدون به فرمولاسیون به بیش از 97 درصد رسید. اضافه کردن پلی وینیل پیرولیدون در فرمولاسیون همراه با پلورونیک، سبب تغییر در رها سازی اولیه و طول دوره رهاسازی شد که به ترتیب کاهش و افزایش یافته بودند. تمام نانوپارتیکل های تشکیل شده دارای پتانسیل زتای بالا و پایدار بودند و یک سوسپانسیون همگن را تشکیل می دادند. با جمع بندی نتایج می توان اظهار داشت که استفاده از سویه بومی رالستونیا پیکتی در تولید پلی هیدروکسی بوتیرات ، راه را برای کاربرد وسیع این پلیمر در پزشکی و داروسازی باز می کند. همچنین از فرمولاسیون نانوپارتیکل های تولید شده، می توان برای کپسوله کردن داروهای متفاوت جهت افزایش نیمه عمر و فعالیت زیستی آنها استفاده کرد.